CN. Khổng Tiết Mây Như, CN. Nguyễn Thị Minh Phượng, ThS. Huỳnh Trọng Kha
Bệnh viện đa khoa Mỹ Đức
 
I. Giới thiệu
Trong lĩnh vực hỗ trợ sinh sản (Assisted Reproductive Technologies - ART), tỉ lệ thụ tinh được coi là một trong những thông số quan trọng giúp tiên lượng khả năng thành công của bệnh nhân khi thực hiện điều trị. Khi tinh trùng xâm nhập vào bên trong noãn bào, quá trình thụ tinh bắt đầu diễn ra, kết quả của quá trình này là sự xuất hiện của hai tiền nhân (pronuclei – PN) đực và cái. Noãn thụ tinh bình thường sẽ có 2PN. Tuy nhiên, trong thực tế vẫn có các trường hợp thụ tinh bất thường dẫn đến hình thành hợp tử 0PN, 1PN, 3PN hoặc nhiều hơn 3PN. Sự bất thường về quá trình hình thành PN thường đi đôi với sự bất thường về nhiễm sắc thể (NST) bên trong hợp tử (1). Theo nghiên cứu của Tong và cộng sự (2023), tỉ lệ lệch bội của phôi phát triển từ hợp tử 0PN và 1PN không có sự khác biệt so với hợp tử 2PN, tỉ lệ lần lượt là 35,9%, 40,0% và 37,3% (P=0,945) (2). Tuy nhiên, đối với hợp tử 3PN, bất thường di truyền cao hơn rõ rệt lên đến 66,7% (3). Trong tự nhiên, tần suất xuất hiện 3PN được ước tính khoảng 1-3%, chiếm khoảng 15-18% các trường hợp bất thường di truyền dẫn đến sẩy thai liên tiếp (4). Đối với các chu kỳ ART, xác suất xuất hiện hợp tử 3PN là 5,0-8,1% trong chu kì thụ tinh trong ống nghiệm cổ điển (conventional in vitro fertilization – cIVF) và 2,5-6,2% trong chu kỳ tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI). Đặc biệt, tỉ lệ này tăng mạnh trong nhóm bệnh nhân lớn tuổi ở cả nam (≥50 tuổi) và nữ (≥40 tuổi) (4). Mặc dù vậy, y văn thế giới vẫn ghi nhận các trường hợp có kết quả phân tích NST bình thường và trẻ sinh sống khỏe mạnh từ hợp tử 3PN. Do đó, với những trường hợp bệnh nhân chỉ có rất ít hoặc không có hợp tử thụ tinh bình thường, tỉ lệ 3PN cao nên cân nhắc tiếp tục nuôi cấy, áp dụng các kỹ thuật phân tích di truyền để đánh giá tiềm năng sử dụng nhằm tăng thêm cơ hội cho bệnh nhân trong các chu kỳ ART. Bài viết này sẽ cập nhật các kết quả lâm sàng của phôi từ hợp tử 3PN sau khi phân tích nguồn gốc của chúng và đưa ra các hướng tiếp cận xử lý phôi từ hợp tử 3PN.
 
II. Cập nhật y văn về phôi phát triển từ hợp tử 3PN

1. Nguồn gốc của hợp tử 3PN

Thể tam bội phát triển từ một hợp tử 3PN là một trong những bất thường NST thường gặp nhất, gây ảnh hưởng đến quá trình mang thai. Ở cấp độ tế bào, thể tam bội được đặc trưng bởi sự tăng thêm một bộ đơn bội (n) vào bộ NST thay vì có bộ NST nguyên bội (2n), từ đó hình thành nên thể tam bội (3n) gọi là diandric triploidy/ diandry – XYY hoặc digynic triploidy/ digyny – XXX/ XXY (5). Diandry phát sinh từ sự thụ tinh của một tế bào noãn đơn bội với hai tinh trùng hoặc một tinh trùng lưỡng bội tạo ra hợp tử 3PN có 2 thể cực; trong khi digyny là trường hợp diễn ra sự thụ tinh của một noãn lưỡng bội với 1 tinh trùng đơn bội tạo ra hợp tử 3PN có một thể cực. Sự tham gia của các giao tử lưỡng bội có thể là kết quả của sự thất bại trong quá trình phân chia giảm phân I hoặc do sự giảm thiểu của các tế bào tiền thân tứ bội (5). Do đó, việc lựa chọn tiêm duy nhất một tinh trùng vào một noãn của phương pháp ICSI có thể giúp loại bỏ diandry nhưng không ngăn được sự hình thành của digyny. Hầu hết các trường hợp hình thành digyny sau ICSI là do noãn không đủ năng lực để tống xuất thể cực thứ hai ra bên ngoài dẫn đến hình thành 3PN. Cụ thể, trong nghiên cứu của Wu và cộng sự (2023), thông qua hệ thống timelapse có thể thấy khoảng 92,1% hợp tử 3PN không có sự tống xuất thể cực thứ hai (6).

2. Kích thước của tiền nhân trong hợp tử 3PN

Trong một số báo cáo gần đây, người ta bắt đầu quan tâm hơn về kích thước của tiền nhân trong hợp tử 3PN. Các phôi nang có nguồn gốc từ hợp tử 3PN với 2PN có kích thước bình thường và 1PN có kích thước nhỏ hơn gọi là 2.1PN (micro 3PN), có thể có đến 85,7% hợp tử có bộ nhiễm sắc thể nguyên bội và có trẻ sinh sống sau khi chuyển phôi (7). Mặc dù cơ chế hình thành 2.1PN vẫn chưa được hiểu rõ, nhưng dựa trên quan sát quá trình phát triển của noãn sau thụ tinh bằng hệ thống timelapse, người ta thấy rằng PN nhỏ được hình thành muộn hơn PN cái và luôn phát triển ngay bên dưới thể cực thứ hai, trước khi di chuyển về phía PN đực. Ở các trường hợp này không có sự khác biệt về kích thước tiền nhân đực giữa hợp tử 2PN và 2.1PN. Tuy nhiên, tiền nhân cái ở hợp tử 2.1PN nhỏ hơn so với hợp tử 2PN. Điều này cho thấy rằng tiền nhân nhỏ thứ 3 có thể là kết quả của một lỗi trong quá trình phân ly nhiễm sắc thể tại thời điểm hình thành thể cực thứ hai (7). Công bố mới nhất của nhóm nghiên cứu Canon và cộng sự (2023) trên 75.903 noãn trưởng thành được ICSI (8). Trong đó, 79,3% là hợp tử 2PN và 0,24% là hợp tử 2.1PN. Tỉ lệ phôi phát triển được đến giai đoạn phôi nang đủ điều kiện sinh thiết có sự chênh lệch đáng kể giữa 2 nhóm (39,8% ở nhóm 2PN so với 23,0% ở nhóm micro 3PN, P<0,00001). Tỉ lệ phôi nguyên bội từ hợp tử 2.1PN cũng thấp hơn so với nhóm 2PN (27,5% so với 51,4%, P=0,06). Có 4 phôi từ hợp tử 2.1PN được chuyển cho bệnh nhân, 3 trường hợp có thai, 1 trường hợp sẩy thai. Điều này rất có ý nghĩa đối với những cặp vợ chồng chỉ có phôi từ hợp tử 2.1PN, vẫn có cơ hội chuyển phôi và có trẻ sinh sống với điều kiện cần thực hiện đánh giá di truyền và được tư vấn kỹ càng.

3. Kết quả lâm sàng của phôi từ hợp tử 3PN

Hiện nay, với sự phát triển của y khoa, các nhà khoa học đã nhận thấy thai nhi phát triển từ hợp tử 3PN có liên quan đến hình thành thai trứng bán phần với tần suất xuất hiện rất hiếm, khoảng 0,005-0,01% (9). Nguyên nhân có thể do sự nhân đôi NST của tinh trùng hoặc noãn được thụ tinh bởi hai tinh trùng hình thành hợp tử tồn tại ở thể tam nhiễm 69XXY, 69XXX và 69XYY, dẫn đến nhiều biến chứng nặng nề. Thai phụ có thể gặp nguy cơ biến chứng không chỉ trong thai kỳ thông thường mà còn kèm theo các nguy cơ của thai trứng (nhiễm độc thai nghén, cường giáp, chảy máu âm đạo, nguy cơ phát triển ung thư nguyên bào nuôi sau sinh), đặc biệt thai nhi cũng chịu nhiều ảnh hưởng (thai kém phát triển, thiếu máu nặng, sẩy thai, sinh non, dị tật) (9). Đối với các chu kỳ ART, hợp tử 3PN sẽ bị loại bỏ và chỉ giữ lại nuôi cấy đến giai đoạn phôi nang nếu không có bất kì hợp tử 2PN nào trong cùng một chu kỳ điều trị. Vì vậy, dữ liệu về kết cục lâm sàng của phôi 3PN rất ít. Nghiên cứu của Mutia và cộng sự (2019) thực hiện phân tích tần suất NST nguyên bội ở 30 phôi từ hợp tử 3PN, kết quả cho thấy chỉ có 33,3% phôi có NST bình thường (46, XX). Tỉ lệ NST bất thường còn lại (69, XXY/XYY/XXX) bao gồm 43,3% là thể tam bội; 13,4% là thể khảm và 10% là thể lệch bội (3). Các phôi có NST bình thường được nuôi cấy đến giai đoạn phôi nang. Phôi lệch bội có xu hướng ngừng phát triển, không thể đạt đến giai đoạn phôi phân chia hoặc phôi nang vì cơ chế chọn lọc tự nhiên của phôi (3). Theo kết luận của Wu và cộng sự (2023), tỉ lệ 3PN >20-25% có thể ảnh hưởng kết cục của một chu kỳ điều trị (6). Bên cạnh đó, kết quả của nghiên cứu khi so sánh giữa 2 nhóm có xuất hiện hợp tử 3PN và nhóm không có 3PN thì tỉ lệ noãn MII, thụ tinh 2PN, phôi tốt ngày 3 và ngày 5 thấp hơn đáng kể. Riêng tỉ lệ phôi khảm cao hơn có ý nghĩa thống kê ở nhóm có xuất hiện hợp tử 3PN lần lượt là 16,3% và 12,1% (P<0,05). Mặc dù vậy, ở một số trường hợp, việc chuyển phôi phát triển từ hợp tử 3PN nguyên bội vẫn mang lại trẻ sinh sống.

III. Phương pháp xử lý phôi từ hợp tử 3PN

1. Xét nghiệm di truyền tiền làm tổ (PGT-A)  

Theo dữ liệu từ nhiều nghiên cứu cho thấy, ở một số trường hợp phôi phát triển từ hợp tử 3PN sau ICSI có thể được sửa sai, điều chỉnh thể tam bội thành thể nguyên bội. Nghiên cứu của Grau và cộng sự (2011) cho thấy có khoảng 62,5% phôi từ 3PN có thể phát triển đến giai đoạn phôi nang, 54,5% trong số đó là phôi nang nguyên bội (10). Ngày nay, những bất thường về NST đã có thể phát hiện trước khi chuyển phôi, đặc biệt đối với nhóm phôi phát triển từ 3PN mang nguy cơ bất thường di truyền cao. Xét nghiệm di truyền tiền làm tổ thể lệch bội (PGT-A) thường được chỉ định trong những trường hợp này, giúp loại bỏ được phôi 3PN lệch bội và giữ lại phôi 3PN nguyên bội cho những bệnh nhân không có phôi từ hợp tử 2PN (11). Theo khuyến cáo thực hành của ESHRE, những hợp tử có từ 3PN nên được loại bỏ tại thời điểm kiểm tra thụ tinh do nguy cơ gia tăng các kết cục lâm sàng bất lợi như sẩy thai, thai trứng, thai chết sau sinh. Như đã đề cập, mặc dù tồn tại rất nhiều nguy cơ nhưng vẫn có trường hợp sinh bé khoẻ mạnh từ hợp tử 3PN. Người mẹ 36 tuổi có tiền sử sẩy thai ở khoảng 13 tuần do trisomy XXY được chỉ định thực hiện ICSI. Thông tin di truyền của phôi được đánh giá bằng phương pháp PGT-A. Một phôi từ 3PN nguyên bội (46, XX) duy nhất được chuyển cho bệnh nhân và sinh một bé gái khỏe mạnh sau 39 tuần với cân nặng 3410g, cao 51cm (12). Có thể thấy việc sử dụng phôi có nguồn gốc từ hợp tử 3PN nguyên bội vẫn có thể mang lại một kết cục lâm sàng tốt cho bệnh nhân, nhấn mạnh tầm quan trọng của PGT-A trong các trường hợp đặc biệt này.

2. Loại bỏ 1 tiền nhân

Một số nghiên cứu đã cố gắng khôi phục trạng thái lưỡng bội của hợp tử 3PN bằng cách loại bỏ tiền nhân thừa. Việc lựa chọn tiền nhân thừa dựa vào vị trí của chúng ở xa thể cực nhất. Thành công của kỹ thuật này đã được báo cáo lần đầu tiên bởi tác giả Kattera và cộng sự (2003), một bé trai khoẻ mạnh đã được sinh ra từ chu kỳ chuyển phôi phát triển từ hợp tử 3PN đã được loại bỏ một tiền nhân. Sau đó, kết quả báo cáo gần đây về việc loại bỏ tiền nhân thừa cho thấy trong 261 hợp tử 3PN được loại bỏ 1 tiền nhân, 79,7% hợp tử sống sót với 2PN còn lại và 94,2% phân chia phôi bào (13). Tỉ lệ phôi nang ở nhóm này đạt 13,5% cao hơn nhiều so với nhóm phôi phát triển từ hợp tử 3PN chỉ có 8,7% (P<0,05). Đánh giá di truyền cho thấy khi đã được loại tiền nhân thừa, tỉ lệ phôi nguyên bội và khảm ở giai đoạn phôi nang lần lượt là 55,0% và 30,0% cải thiện tốt hơn khi so sánh với nhóm phôi 3PN bị dừng phát triển ở giai đoạn phôi phân chia (18,4% và 59,2%; P<0,05). Đặc biệt, tỉ lệ tam bội của những phôi này chỉ còn 5,7% thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với hợp tử 3PN không thực hiện loại bỏ tiền nhân (19,4%; P<0,01). Bên cạnh đó, một số nghiên cứu còn chỉ ra khả năng tạo lại trục lưỡng cực bình thường bằng cách loại bỏ một lượng nhỏ tế bào chất xung quanh tiền nhân thừa, các trung thể thừa sẽ được loại bỏ, điều này không chỉ khôi phục lại bộ NST lưỡng bội mà còn cải thiện tiềm năng phát triển sau chỉnh sửa (13). Như vậy, sự kết hợp loại bỏ tiền nhân thừa và nuôi cấy đến giai đoạn phôi nang sẽ hiệu quả hơn để xác định phôi lưỡng bội bình thường; thế nhưng, việc xem xét các nguy cơ về bất thường khảm, đa bội và lệch bội bằng PGT-A vẫn nên được thực hiện. Mặc dù vậy, một số báo cáo khác lại cho rằng việc loại bỏ tiền nhân thừa không thể điều chỉnh được sự phân chia bất thường của hợp tử. Do đó, tiềm năng của kỹ thuật này chưa có nhiều bằng chứng rõ ràng và còn nhiều tranh cãi (13).

3. Hệ thống chỉnh sửa hệ gene CRISPR/Cas  

Sự phát triển gần đây của công nghệ DNA endonuclease giới hạn như hệ thống chỉnh sửa hệ gene (short palindromic repeat- associated nuclease system - CRISPR/Cas) đã mở ra một hướng tiếp cận mới, ứng dụng kỹ thuật bộ gene và mở rộng trên đa dạng loài. Hệ thống này liên kết với trình tự DNA mục tiêu (target DNA) trong bộ gene với mục đích tạo ra đứt gãy chuỗi DNA kép (DNA double strand break – DSB) sửa đổi trình tự DNA cụ thể (14). Theo cơ chế tự sửa chữa của tế bào, đoạn DNA sau khi bị cắt sẽ được gắn lại theo con đường tái tổ hợp tương đồng bằng cách sử dụng khuôn mẫu có trình tự tương đồng ở khớp nối nên bảo toàn được trình tự DNA với khả năng phân tách gene β-globin (HBB) nội sinh nhưng hiệu quả thấp chỉ 25% và phôi đã chỉnh sửa bị khảm. Đến năm 2022, công nghệ DddA-derived cytosine base editor (DdCBE) chỉnh sửa DNA ti thể (mitochondrial DNA – mtDNA) ở phôi người có hợp tử 3PN lần đầu được phân tích bằng việc vi tiêm các mRNA DdCBE đã chọn có thể làm trung gian cho C-G thành T-A, chuyển đổi hiệu quả tại các vị trí mtDNA mong muốn trong phôi 3PN với các đột biến liền kề bị giới hạn (15). Mặc dù CRISPR/Cas đang được thử nghiệm trên tế bào mầm người và phôi giai đoạn sớm nhưng vẫn còn tồn tại nhiều thách thức vì hiệu quả thấp và nguy cơ xảy ra đột biến ngoài đích (off-target); đồng thời, phương pháp này vướng phải các vấn đề đạo đức trong việc can thiệp chỉnh sửa gene người nên cần rất nhiều nghiên cứu sâu hơn trước khi ứng dụng lâm sàng.

IV. Kết luận
Từ dữ liệu hiện tại cho thấy phôi từ hợp tử 3PN nguyên bội có thể được cân nhắc sử dụng nếu không có bất kì phôi nào từ hợp tử 2PN trong các chu kỳ ART. Tuy nhiên, cần thực hiện các phương pháp sàng lọc, kiểm tra kỹ lưỡng bất thường NST phôi, cũng như tư vấn các rủi ro bệnh nhân có thể gặp phải trước khi quyết định sử dụng phôi từ hợp tử 3PN. Bên cạnh đó, những nghiên cứu về kỹ thuật và phương pháp mới xử lý phôi từ hợp tử 3PN hiện nay nên được thực hiện và hướng đến ứng dụng trong tương lai để giúp hỗ trợ cho việc cung cấp nguồn phôi an toàn trong các trường hợp này.

V. Tài liệu tham khảo

1. Arroyo G, Veiga A, Santaló J, Barri PN. Developmental prognosis for zygotes based on pronuclear pattern: usefulness of pronuclear scoring. J Assist Reprod Genet. 2007 May;24(5):173-81.
2. Tong X, Jin J, Xue Y, Fang L, Zhu H, Jiang L, Zhang S. Clinical outcomes of frozen-thawed blastocysts from zygotes with no or one pronucleus for in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection cycles. Arch Gynecol Obstet. 2023 Sep;308(3):1015-1022.
3. Mutia K, Wiweko B, Iffanolida PA, Febri RR, Muna N, Riayati O, Jasirwan SO, Yuningsih T, Mansyur E, Hestiantoro A. The Frequency of Chromosomal Euploidy Among 3PN Embryos. J Reprod Infertil. 2019 Jul-Sep;20(3):127-131. 
4. Li M, Zhao W, Xue X, Zhang S, Shi W, Shi J. Three pro-nuclei (3PN) incidence factors and clinical outcomes: a retrospective study from the fresh embryo transfer of in vitro fertilization with donor sperm (IVF-D). Int J Clin Exp Med. 2015 Aug 15;8(8):13997-4003.
5. Figueira RC, Setti AS, Braga DP, Iaconelli A Jr, Borges E Jr. Prognostic value of triploid zygotes on intracytoplasmic sperm injection outcomes. J Assist Reprod Genet. 2011 Sep;28(10):879-83.
6. Wu X.H, Jiang Y, Yuan J.C, Song GE, Geng C.P, Zhang X.H. Effect of three pro-nuclei (3PN) on the outcomes of PGT. Research Square. 2023 Jul.
7. Capalbo A, Treff N, Cimadomo D, Tao X, Ferrero S, Vaiarelli A, Colamaria S, Maggiulli R, Orlando G, Scarica C, Scott R, Ubaldi FM, Rienzi L. Abnormally fertilized oocytes can result in healthy live births: improved genetic technologies for preimplantation genetic testing can be used to rescue viable embryos in vitro fertilization cycles. Fertil Steril. 2017 Dec;108(6):1007-1015.e3.
8. Canon C, Thurman A, Li A, Hernandez-Nieto C, Lee JA, Roth RM, Slifkin R, Briton-Jones C, Stein D, Copperman AB. Assessing the clinical viability of micro 3 pronuclei zygotes. J Assist Reprod Genet. 2023 Jul;40(7):1765-1772. 
9. Franciscis P, Schiattarella A, Labriola D, Tammaro C, Messalli EM, La Mantia E, Montella M, Torella M. A partial molar pregnancy associated with a fetus with intrauterine growth restriction delivered at 31 weeks: a case report. J Med Case Rep. 2019 Jul 4;13(1):204.
10. Grau N, Escrich L, Martín J, Rubio C, Pellicer A, Escribá MJ. Self-correction in tripronucleated human embryos. Fertil Steril. 2011 Oct;96(4):951-6. 
11. Chen S, Huang P, Sun Y, Du S, Lin Y, Zheng B, Lin D. Tripronuclear Zygotes in IVF Laboratory Quality Control: Experimental Evaluation and Potential Applications. Int J Gen Med. 2022 Jan 28;15:949-954. 
12. Yalçınkaya E, Özay A, Ergin EG, Öztel Z, Özörnek H. Live birth after transfer of a tripronuclear embryo: An intracytoplasmic sperm injection as a combination of microarray and time-lapse technology. Turk J Obstet Gynecol. 2016 Jun;13(2):95-98.
13. Liao HQ, OuYang Q, Zhang SP, Cheng DH, Lu GX, Lin G. Pronuclear removal of tripronuclear zygotes can establish heteroparental normal karyotypic human embryonic stem cells. J Assist Reprod Genet. 2016 Feb;33(2):255-63.
14. Kang X, He W, Huang Y, Yu Q, Chen Y, Gao X, Sun X, Fan Y. Introducing precise genetic modifications into human 3PN embryos by CRISPR/Cas-mediated genome editing. J Assist Reprod Genet. 2016 May;33(5):581-588.
15. Chen X, et al. DdCBE-mediated mitochondrial base editing in human 3PN embryos. Cell Discov. 2022;8(1):8.

Từ khóa: Nguồn phôi từ hợp tử 3pn có nên sử dụng: cập nhật y văn thế giới